一、什么是SNP ?

SNP，即单核苷酸多态性，是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异而引起的一种DNA序列多态性。

SNP研究具有广泛意义，在农业领域中，可以进行性状基因的精细定位、分子辅助育种、种子资源鉴定等；在医学领域中，则主要是疾病的分子遗传机制研究、疾病基因定位、药物敏感或疾病易感性位点筛选等。

二、SNP研究内容有哪些?

SNP的研究主要分为SNP的发现及SNP的基因分型。

SNP的发现是应用的基础，需要在一定数量样本的全基因组范围内，经过统计学分析得到少量可能与疾病或性状关联的SNPS。这时基因芯片或NGS(Next Generation Sequencing，第二代测序技术)技术在单个样品的大量SNP检测中具有优势。

SNP的基因分型是应用的技术手段。这一过程需要检测大量样本的少量SNPs，而基因芯片或NGS技术则由于其高成本不太适合此阶段的研究。KASP（Kompetitive Allele Specific PCR,竞争性等位基因特异性PCR）因其经济灵活的特点，作为国际上主流SNP检测方法之一，替代传统的高通量测序，在SNP分型研究中发挥重要作用。

三、 KASP技术原理

KASP技术基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels (Insertions and Deletions，插入和缺失)。该技术原理如下：

第一步：竞争性特异引物设计
a.设计2个SNP PCR特异性引物，各对应于一个SNP的等位基因，如图：

Allele 1引物3'末端是A；Allele 2引物3'末端是C标签序列。
Allele 1引物5'末端是FAM序列；Allele 2引物5'末端是HEX标签序列。

b.设计荧光探针
F探针与Allele 1标签序列一致；H探针与Allele 2标签序列一致。
F探针的5'端有一个FAM荧光基团；H探针的5'端有一个HEX荧光基团。
相应于F探针和H探针，各设计一个3'端带淬灭基团的淬灭探针。

第二步：第1轮 PCR，特异性引物扩增

第1轮PCR，模板会与可互补的（3'末端能配对的）PCR引物进行退火，并发生扩增。

这步完成SNP识别

第三步：第2轮 PCR，反向通用引物扩增

第2轮PCR扩增，扩增出带有标签序列的PCR产物。

这步完成把通用标签序列引入与SNP对应的PCR产物。

第四步：第3轮 PCR，荧光产生

经过接下来几轮的PCR扩增，一方面淬灭探针被切碎，另一方面荧光探针更多地退火到新合成的、没有淬灭基团的互补链上，发出荧光。

通过检测荧光，检出SNP位点上是哪个碱基。

第五步：结果展示

四、 KASP应用案例

KASP 技术由于其高通量、低成本和检测效率高等优点而在农作物性状遗传和改良研究领域备受关注，现已在全球广泛应用。

1.KASP技术在种质资源鉴定及亲缘关系研究中的应用

江苏省农业科学院赵涵团队利用不同来源的玉米自交系，通过全基因组重测序数据鉴定出了一系列SNPs位点并开发出700 对KASP 分子标记，从中选择验证过的202 对KASP 标记用于系统进化树构建及群体结构分析。结果显示，基于KASP 标记位点和基于总SNPs 位点的聚类分析结果高度吻合，两者的遗传距离相似性系数高达89.5%，能成功区分玉米的杂种优势群。此套KASP 标记可在玉米种质资源分析、连锁群构建以及杂种优势群划分等方面发挥重要作用。

参考文献：
陆海燕, 周玲, 林峰, 等. 基于高通量测序开发玉米高KASP 分子标记［J］. 作物学报, 2019, 45（6）：872-878.

2.KASP技术在分子辅助育种中的应用

案例一：

北京农林科学院玉米研究所赵久然团队利用B73×高油玉米的F2:3分离群体、BSR-seq及基因等位性测验技术进行分析，发现su1和sh2-R分别提高玉米籽粒含油率4.20个百分点和7.66个百分点，根据这两个基因的关键突变位点开发了基因功能性KASP标记，能够成功区分183份玉米材料中su1su1Sh2Sh2、Su1Su1sh2sh2和su1su1sh2sh2不同突变类型，对高油甜玉米育种具有重要的应用价值。发现候选基因GRMZM2G176998（WD40类β-螺旋重复蛋白）、GRMZG2G021339（homeobox转录因子）和 GRMZM2G167438（3-酮酰基-CoA合成酶）的KASP标记与分离群体中单株的籽粒含油量显著相关。

参考文献：
Luo MJ, Lu BS, Shi YX, et al. Genetic basis of the oil biosynthesis in ultra-high-oil maize grains with an oil content exceeding 20%. Front Plant Sci, 2023, 14:1168216.

案例二：

美国俄克拉荷马州立大学Yan Liuling团队针对小麦抗叶锈基因Lr34 开发了两对KASP 标记：Lr34-E11-KASP 和Lr34-E22-KASP，此两对标记可在小麦育种工作中加速对Lr34 基因的选择。

参考文献：
Fang TL, Lei L, Li GQ, et al. Development and deployment of KASP markers for multiple alleles of Lr34 in wheat［J］. Theor Appl Genet, 2020, 133（7）：2183-2195.

3.KASP技术在遗传图谱构建与基因定位中的应用

中国农科院刘录祥课题组利用由中玉金标记独家代理的小麦55K芯片对突变体eh1 和LX987及其杂交获得的207个RIL进行遗传作图，共检测到37个QTL，分别与抽穗期、株高、千粒重、穗长等农艺性状相关，并成功开发了25对KASP标记。利用 400 个 RIL 对 3A、4B 和 6A 染色体上稳定检测到的 QTL 进行验证。将4B染色体上控制株高和千粒重的 QTL 簇界定在一个 0.8 Mb 的物理区间内，3A 染色体上控制抽穗期的 QTL 被缩小到 2.5 Mb 的区间。 

参考文献：
Xiong HC, Li YT, Guo HJ, et al. Genetic mapping by integration of 55K SNP array and KASP markers reveals candidate genes for important agronomic traits in hexaploid wheat［J］. Front Plant Sci, 2021, 12 ：628478.

4.KASP技术在种子纯度鉴定中的应用

北京市农林科学院玉米研究所王蕊、施建龙、田红丽等基于12套杂交种及其父母本的三联体样本及335 份玉米杂交种国家审定标准样品SNP 指纹, 从384 个SNP 基础位点筛选获得60 个候选位点, 位点转化为KASP 引物的成功率为95%。综合考虑标记双亲互补率、多态性、稳定性和分型效果等多项指标，最终确定20个标记作为玉米杂交种纯度鉴定的核心标记，这些标记能够有效鉴定99.7%供试样品纯度。

图 测试引物分型效果图

表 玉米杂交种纯度鉴定SNP 核心引物信息表

参考文献：
王蕊，施龙建,田红丽等. 玉米杂交种纯度鉴定SNP 核心引物的确定及高通量检测方案的建立［J］. 作物学报, 2021, 47（4）：770-779.